题目内容：

谁能总结以下SDS-PAGE电泳常见问题的分析

优质解答

　　哈哈,我做过这个论文哈!
　　1. 配胶缓冲液系统对电泳的影响?
　　在SDS－PAGE不连续电泳中,制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统,浓缩胶是pH6.7,分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统.在浓缩胶中,其pH环境呈弱酸性,因此甘氨酸解离很少,其在电场的作用下,泳动效率低；而CL离子却很高,两者之间形成导电性较低的区带,蛋白分子就介于二者之间泳动.由于导电性与电场强度成反比,这一区带便形成了较高的电压剃度,压着蛋白质分子聚集到一起,浓缩为一狭窄的区带.当样品进入分离胶后,由于胶中pH的增加,呈碱性,甘氨酸大量解离,泳动速率增加,直接紧随氯离子之后,同时由于分离胶孔径的缩小,在电场的作用下,蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离.
　　所以,pH对整个反应体系的影响是至关重要的,实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况,应首要考虑该因素.
　　2. 样品如何处理?
　　根据样品分离目的不同,主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理.
　　1）还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后,蛋白质构象被解离,电荷被中和,形成SDS与蛋白相结合的分子,在电泳中,只根据分子量来分离.一般电泳均按这种方式处理,样品稀释适当浓度,加入上样Buffer,离心,沸水煮5min,再离心加样.
　　2）带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团,得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT,而防止银染时的纹理现象.100ul样品缓冲液中10ul 20％的碘乙酸胺,并在室温保温30min.
　　3）非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品,一般只用1％SDS沸水中煮3min,未加还原剂,因而蛋白折叠未被破坏,不可作为测定分子量来使用.
　　3. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用?
　　聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体,其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否,与促凝剂及环境密切相关；
　　制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7,分离胶选择pH8.9,选择tris－HCL系统,TEMED与AP：AP提供自由基,TEMED是催化剂,催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基硫酸钠（SDS）：阳离子去污剂,作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠.
　　4. 提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径?
　　聚丙烯酰胺的充分聚合,可提高凝胶的分辨率.建议做法：待凝胶在室温凝固后,可在室温下放置一段时间使用.忌即配即用或4度冰箱放置,前者易导致凝固不充分,后者可导致SDS结晶.一般凝胶可在室温下保存4天,SDS可水解聚丙烯酰胺.
　　一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料,不同染料又各自不同的染色方法,具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103.
　　5.“ 微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因?
　　主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致,多出现于较厚的凝胶中.
　　处理办法：待其充分凝固再作后续实验.
　　6. “皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因?
　　主要出现在蛋白质垂直电泳槽中,一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净.
　　处理办法：可在两板间加入适量缓冲液,以排除气泡.
　　7. 为什么带出现拖尾现象?
　　主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的.
　　处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液,加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长,重新配制；降低凝胶浓度.
　　8. 为什么带出现纹理现象?
　　主要是样品不溶性颗粒引起的.
　　处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂.
　　9. 什么是“鬼带”,如何处理?
　　“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时,常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀,主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性,致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合,聚合成大分子,其分子量要比目标条带大,有时不能进入分离胶.但它却于目标条带有相同的免疫学活性,在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用.
　　处理办法：在加热煮沸后,再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇,以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化.
　　10. 为什么溴酚蓝不能起到指示作用?
　　我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底,但蛋白质却还未跑下来的现象.主要与缓冲液和分离胶的浓度有关.
　　处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度.
　　11. 为什么电泳的条带很粗?
　　电泳中条带很粗是常见的事,主要是未浓缩好的原因.
　　处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确（6.7）；适当降低电压；
　　12. 为什么电泳电压很高而电流却很低呢?
　　这种现象一般初学者易出现.比如电压50v以上,可电流却在5mA以下.主要是由于电泳槽没有正确装配,电流未形成通路.包括：a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）.
　　处理办法：电泳槽正确装配即可.
　　13. 浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗?
　　这主要出现在初学者中,一般对电泳不会有太大的影响.前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后,板未压紧而致空气进入引起的.
　　14. 凝胶时间不对,或慢或快,怎么回事?
　　通常胶在30MIN-1H内凝.如果凝的太慢,可能是TEMED,APS剂量不够或者失效.APS应该现配现用,TEMED不稳定,易被氧化成黄色. 如果凝的太快,可能是APS和TEMED用量过多,此时胶太硬易裂,电泳时易烧胶.
　　15. 电泳时间比正常要长?
　　可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误,即缓冲系统地PH和被分离物质的等电点差别太小,或缓冲系统的离子强度太高.