题目内容：

鸡干扰素是一种具有高效和广谱抗病毒作用的细胞因子，广泛用于动物领域的抗病毒治疗。科研人员将鸡干扰素基因作为目的基因，构建基因表达载体，通过农杆菌介导法导入烟草，以获得抗病毒烟草。下图为科研人员制备能合成鸡干扰素的烟草愈伤组织细胞的流程，①～④表示相关的操作，两种限制酶的识别序列及切割位点如表所示。请回答下列问题：

（1）步骤①中，利用PCR技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是__________。科研人员还在两种引物的一端分别加上了__________和__________序列，以便于后续的剪切和连接，一个DNA分子三轮复制以后，含有两种引物的DNA分子有__________个。为防止酶切产物自身环化，构建表达载体需用两种限制酶，选择的原则是__________。

A. Ti质粒内，每种限制酶只有一个切割位点

B. 目的基因编码蛋白质的序列中，每种限制酶只有一个切割位点

C. 酶切后，目的基因形成的两个黏性末端序列不相同

D. 酶切后，Ti质粒形成的两个黏性末端序列相同

（2）步骤②所构建的基因表达载体中未标注出的必需元件还有__________，步骤③中需先用__________处理农杆菌以便将基因表达载体导入细胞。

（3）步骤④中，科研人员提取愈伤组织细胞的RNA后，先通过__________获得DNA，再进行PCR扩增，若最终未能检测出干扰素基因，其可能原因是__________。